在植物科學(xué)領(lǐng)域，解析轉(zhuǎn)錄因子與DNA的互作機(jī)制是構(gòu)建基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心，更是揭示植物生長發(fā)育、逆境適應(yīng)等生命過程分子機(jī)制的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的ChIP-seq技術(shù)依賴高質(zhì)量特異性抗體，這一局限性使非模式植物的研究面臨巨大挑戰(zhàn)。DAP-seq（DNA Affinity Purification Sequencing，DNA親和純化測序）技術(shù)的出現(xiàn)，為研究模式和非模式植物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究提供了高效、精準(zhǔn)的解決方案。本文將系統(tǒng)解析三種基于DAP-seq的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究思路，以期為相關(guān)領(lǐng)域的科研工作者提供有益的思路與啟發(fā)。

一、技術(shù)介紹

（一）核心原理

DAP-seq通過體外表達(dá)出含有標(biāo)簽（如His、Halo標(biāo)簽）的目的蛋白，利用標(biāo)簽特異性配體純化蛋白，再與基因組DNA片段孵育結(jié)合，然后富集與目的蛋白結(jié)合的DNA，經(jīng)高通量測序及生物信息學(xué)分析，在全基因組范圍內(nèi)鑒定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)（TFBS）。該技術(shù)無需目的蛋白特異性抗體，無需轉(zhuǎn)基因材料，即可揭示轉(zhuǎn)錄因子與DNA的互作網(wǎng)絡(luò)。

（二）藍(lán)景科信DAP-seq技術(shù)路線圖

（三）技術(shù)優(yōu)勢

自2016年在《Cell》發(fā)表，2017年《Nature Protocols》發(fā)布標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)方法以來，DAP-seq迅速成為解析轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵技術(shù)。截至目前，藍(lán)景科信使用該技術(shù)，已助力科學(xué)家在植物生長發(fā)育、逆境脅迫響應(yīng)、果實(shí)發(fā)育、系統(tǒng)進(jìn)化等多個(gè)研究方向取得突破，相關(guān)研究成果發(fā)表于Cell、Molecular Plant、Plant Biotechnology Journal、Plant Cell、PNAS、Plant Communications、New Phytologist、Plant Physiology等期刊。

二、三大實(shí)用研究思路與藍(lán)景科信案例解析

（一）研究思路一：DAP-seq + 下游驗(yàn)證——精準(zhǔn)鎖定靶基因調(diào)控關(guān)系

該思路以 “全基因組篩選 + 靶向驗(yàn)證" 為核心，先通過DAP-seq定位轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合RNA-seq篩選差異表達(dá)靶基因，再經(jīng)體外與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證直接調(diào)控關(guān)系，是最基礎(chǔ)且高效的研究框架。這是DAP-seq最基礎(chǔ)且高效的研究框架，通過“全基因組篩選+靶向驗(yàn)證"的流程，明確轉(zhuǎn)錄因子與靶基因的直接調(diào)控關(guān)系。

篩選階段：利用DAP-seq定位轉(zhuǎn)錄因子的全基因組結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合RNA-seq篩選基因表達(dá)差異顯著的靶標(biāo)，通過聯(lián)合分析縮小核心調(diào)控基因范圍。

驗(yàn)證階段：體外通過EMSA（凝膠遷移實(shí)驗(yàn)）、Y1H（酵母單雜）驗(yàn)證蛋白與DNA的特異性結(jié)合，體內(nèi)通過ChIP-qPCR（染色質(zhì)免疫共沉淀-實(shí)時(shí)熒光定量PCR）、Dual-LUC（雙熒光素酶報(bào)告基因檢測）確認(rèn)調(diào)控關(guān)系。

案例1：紫花苜蓿MsMYB35調(diào)控花藥發(fā)育研究

文章題目：Anther-specific expression of MsMYB35 transcription factor in alfalfa (Medicago sativa L.) and its crucial role in pollen development

發(fā)表期刊和時(shí)間：The Plant Journal（2025）

技術(shù)組合：DAP-seq、RNA-seq、Y1H、Dual-LUC

核心發(fā)現(xiàn)：DAP-seq鑒定出14,992個(gè)結(jié)合峰，其中8,097個(gè)高可靠性位點(diǎn)富集于基因間區(qū)（62.7%）和啟動(dòng)子區(qū)（16.6%），富集到AAAAA、TAAC、GA(A/G)三類保守基序，對(duì)應(yīng)3,647個(gè)靶基因；聯(lián)合RNA-seq篩選出467個(gè)直接調(diào)控基因，富集于苯丙烷代謝、茉莉酸（JA）合成、細(xì)胞壁重塑（如果膠裂解酶通路）等花藥發(fā)育相關(guān)通路。酵母單雜交（Y1H）實(shí)驗(yàn)和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（Dual-LUC）證實(shí)MsMYB35可結(jié)合并激活MsJMT和MsPL基因表達(dá)，過表達(dá)MsMYB35促進(jìn)花藥發(fā)育，沉默則導(dǎo)致花粉不育，外源MeJA可恢復(fù)育性。

科學(xué)價(jià)值：本研究明確了MsMYB35的核心調(diào)控作用，為紫花苜蓿分子育種和雜交制種提供理論支撐。

案例2：軟棗獼猴桃花青素調(diào)控機(jī)制研究

文章題目：Chromosome-level genome assembly assisting for dissecting mechanism of anthocyanin regulation in kiwifruit (Actinidia arguta)

發(fā)表期刊和時(shí)間：Molecular Horticulture（2025）

技術(shù)應(yīng)用：DAP-seq、RNA-seq、EMSA、Y1H、ChIP-qPCR、Dual-LUC

核心發(fā)現(xiàn)：組裝全紅軟棗獼猴桃染色體水平基因組，通過對(duì)不同顏色的軟棗獼猴桃品種進(jìn)行RNA-seq分析，篩選出花青素抑制因子AaBEE1；DAP-seq鑒定AaBEE1在全基因組范圍內(nèi)的457個(gè)結(jié)合峰，靶基因顯著富集于黃酮類生物合成通路，其中LDOX基因與果實(shí)顏色緊密相關(guān)。通過Y1H、EMSA、ChIP-qPCR和LUC等實(shí)驗(yàn)證實(shí)AaBEE1通過結(jié)合AaLDOX啟動(dòng)子的G-box區(qū)域抑制其表達(dá)，且AaLDOX啟動(dòng)子的29-bp indel 變異可影響基因表達(dá)效率。

研究思路二：DAP-seq + 互作蛋白——解析調(diào)控網(wǎng)絡(luò)協(xié)同機(jī)制

在明確靶基因調(diào)控關(guān)系的基礎(chǔ)上，結(jié)合蛋白互作研究可豐富調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性解析。該思路以DAP-seq和RNA-seq篩選靶基因?yàn)楹诵模蟉2H、Co-IP、蛋白Pull-down、BiFC等蛋白互作研究技術(shù)，揭示轉(zhuǎn)錄因子與其他蛋白的協(xié)同作用模式，深化對(duì)調(diào)控機(jī)制的理解。

蛋白互作研究方法

酵母雙雜交（Y2H）作為經(jīng)典的蛋白互作研究方法，利用酵母轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征，通過觀察酵母在營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上的生長情況或顯色活性判斷蛋白互作。

免疫共沉淀（Co-IP）可在細(xì)胞內(nèi)天然狀態(tài)下捕獲相互作用蛋白，通過WesternBlotting或質(zhì)譜進(jìn)行分析。

蛋白Pull down是體外研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，基于親和層析原理，將誘餌蛋白與特定標(biāo)簽形成融合蛋白進(jìn)行表達(dá)純化，進(jìn)而捕獲并鑒定與之相互作用的蛋白。

雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）則能直觀判斷目標(biāo)蛋白在活細(xì)胞中的定位和相互作用。

熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)（LCI）可通過檢測發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度評(píng)估蛋白間相互作用及強(qiáng)度。

案例3：擬南芥雄性育性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)解析

文章標(biāo)題：A DELLA-ANAC106 reciprocal negative feedback circuit modulates gibberellin homeostasis to regulate male fertility in Arabidopsis

發(fā)表期刊和時(shí)間：New Phytologist（2025）

技術(shù)應(yīng)用：DAP-seq、RNA-seq、EMSA、Dual-LUC、Y2H、CO-IP

核心發(fā)現(xiàn)：本研究鑒定出NAC轉(zhuǎn)錄因子ANAC106，它在擬南芥幼嫩花藥中高表達(dá)，其過表達(dá)或顯性負(fù)抑制均會(huì)導(dǎo)致絨氈層降解異常（提前或延遲），進(jìn)而引發(fā)雄性不育。借助DAP-seq結(jié)合RNA-seq數(shù)據(jù)分析，研究鎖定ANAC106的直接靶標(biāo)為GA合成基因GA3ox2/4和分解基因GA2ox1；EMSA與Dual-LUC實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，ANAC106可激活GA3ox2/4的轉(zhuǎn)錄。通過Y2H和Co-IP顯示ANAC106與4種DELLA蛋白（RGA、GAI等）互作，互作區(qū)域?yàn)锳NAC106的N端，且DELLA蛋白以劑量依賴方式抑制ANAC106活性。二者形成雙向負(fù)反饋回路，通過調(diào)控GA穩(wěn)態(tài)維持雄性育性。

案例4：番茄果實(shí)成熟調(diào)控機(jī)制研究

文章標(biāo)題：Protein phosphatase PP2C2 dephosphorylates transcription factor ZAT5 and modulates tomato fruit ripening

發(fā)表期刊和時(shí)間：Plant Physiology（2025）

技術(shù)應(yīng)用：DAP-seq、RNA-seq、Y1H、EMSA、ChIP-qPCR、Dual-LUC、Y2H、CO-IP、BiFC、LCI、蛋白pull-down

核心發(fā)現(xiàn)：SlZAT5負(fù)調(diào)控番茄果實(shí)成熟，DAP-seq結(jié)合RNA-seq鑒定到1511個(gè)成熟相關(guān)靶基因（含SlACS4、SlPL8、SlGRAS38等關(guān)鍵基因），經(jīng)Y1H、Dual-LUC、ChIP-qPCR和EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)SlZAT5可直接結(jié)合這些基因啟動(dòng)子并抑制其表達(dá)；。進(jìn)一步通過Y2H篩選出SlZAT5的互作蛋白SlPP2C2，經(jīng)BiFC、LCI、蛋白pull-down、Co-IP及亞細(xì)胞共定位實(shí)驗(yàn)確認(rèn)二者在細(xì)胞核內(nèi)相互作用，SlPP2C2通過去磷酸化SlZAT5的Ser-65位點(diǎn)，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄抑制活性，進(jìn)而影響乙烯合成與果實(shí)成熟。

研究思路三：DAP-seq+多組學(xué)聯(lián)用——拓展研究深度與廣度

將DAP-seq與ATAC-seq等多組學(xué)技術(shù)結(jié)合，從DNA結(jié)合、染色質(zhì)可及性、基因表達(dá)等多維度解析調(diào)控機(jī)制，拓展研究的深度與廣度，尤其適用于復(fù)雜性狀調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析。

案例5：小麥氮高效利用與產(chǎn)量提升機(jī)制研究

文章題目：An incoherent feed-forward loop coordinates nitrate uptake and tillering in wheat

發(fā)表期刊和時(shí)間：Molecular Plant（2025）

技術(shù)應(yīng)用：DAP-seq、ATAC-seq、RNA-seq、ChIP-qPCR、Y2H、Co-IP、BiFC、Y1H

核心發(fā)現(xiàn)：TaNLP3是硝酸鹽響應(yīng)核心調(diào)控因子，與TaLBD38、TaNRT2.1構(gòu)成非一致性前饋環(huán)路；Y2H證實(shí)TaNLP3與SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物互作；ATAC-seq與DAP-seq聯(lián)合分析顯示，TaNLP3缺失顯著降低硝酸鹽誘導(dǎo)的染色質(zhì)可及性，共調(diào)控4008個(gè)靶基因，參與氮吸收、同化等過程。同時(shí)鑒定的優(yōu)異單倍型（TaNLP3-3BHap2等）為小麥高產(chǎn)高效育種提供遺傳資源。

藍(lán)景科信：轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究的合作伙伴

藍(lán)景科信深耕功能基因組學(xué)領(lǐng)域，累計(jì)完成260+物種，4000+轉(zhuǎn)錄因子的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，憑借高質(zhì)量的服務(wù)，已助力合作客戶在Cell，Science，Molecular Plant，Plant Biotechnology Journal，Journal of Advanced Research，Plant Cell，PNAS等數(shù)十期刊發(fā)表高質(zhì)量研究成果。

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